2 Mix Ipọpọ Pfu PCR

A-1 Àdàkọ

Template Awoṣe naa ni awọn idoti amuaradagba tabi awọn alatako Taq, ati bẹbẹ lọ——— Ṣe awoṣe DNA di mimọ, yọ awọn idoti amuaradagba kuro tabi yọ DNA awoṣe kuro pẹlu awọn ohun elo iwẹnumọ.

Kikopa ti awoṣe ko pari ——Bi o ṣe yẹ ki o mu iwọn otutu denaturation pọ si ati mu akoko denaturation gun.

Deg Irẹwẹsi awoṣe --— Tun-mura awoṣe naa.

A-2 alakoko

Quality Didara to dara ti awọn alakoko ——Re-synthesize primer.

Deg Irẹjẹ alakọbẹrẹ ——Aliquot awọn alakoko ifọkansi giga sinu iwọn kekere fun titọju. Yago fun didi pupọ ati thawing tabi igba pipẹ 4 ° C cryopreserved.

Design Apẹrẹ aipe ti awọn alakoko (fun apẹẹrẹ ipari alakoko ko to, dimer ti a ṣe laarin awọn alakoko, ati bẹbẹ lọ) -Resesign primers (yago fun dida ti alakoko alakoko ati eto ile -iwe keji)

A-3 Mg²⁺fojusi

G Mg²⁺ ifọkansi ti lọ silẹ pupọ ——Pi alekun Mg daradara²⁺ fojusi: Mu Mg naa dara si²⁺ ifọkansi nipasẹ lẹsẹsẹ awọn aati lati 1 mM si 3 mM pẹlu aarin 0.5 mM lati pinnu Mg ti o dara julọ²⁺ ifọkansi fun awoṣe kọọkan ati alakoko.

A-4 Afikun iwọn otutu

Temperature Iwọn otutu otutu ti o ga yoo ni ipa lori isopọ ti alakoko ati awoṣe. —— Din iwọn otutu fifẹ silẹ ki o mu ipo naa dara pẹlu gradient ti 2 ° C.

A-5 Ifaagun akoko

Time Akoko itẹsiwaju kukuru —— Mu akoko itẹsiwaju pọ si.

Phenomena: Awọn ayẹwo ti ko dara tun ṣafihan awọn ẹgbẹ ọkọọkan ibi -afẹde.

A-1 Kontaminesonu ti PCR

Koja kontaminesonu ti ọkọọkan ibi -afẹde tabi awọn ọja imudarasi—— Ṣọra ki a ma ṣe fa fifalẹ ayẹwo ti o ni ọkọọkan ibi -afẹde ninu ayẹwo odi tabi da wọn jade kuro ninu tube centrifuge. Awọn reagents tabi ohun elo yẹ ki o jẹ adaṣe lati yọkuro awọn acids nucleic ti o wa, ati pe aye ti kontaminesonu yẹ ki o pinnu nipasẹ awọn adanwo iṣakoso odi.

Contamin Kontaminesonu reagent ——Aliquot awọn reagents ati fipamọ ni iwọn otutu kekere.

A-2 NOMBAr

G Mg²⁺ ifọkansi ti lọ silẹ pupọ ——Pi alekun Mg daradara²⁺ fojusi: Mu Mg naa dara si²⁺ ifọkansi nipasẹ lẹsẹsẹ awọn aati lati 1 mM si 3 mM pẹlu aarin 0.5 mM lati pinnu Mg ti o dara julọ²⁺ ifọkansi fun awoṣe kọọkan ati alakoko.

Design Apẹrẹ alakọbẹrẹ ti ko pe, ati ọkọọkan ibi-afẹde naa ni isọdọkan pẹlu tito lẹsẹsẹ ti kii ṣe ibi-afẹde. ——Re-design alakoko.

Phenomena: Awọn ẹgbẹ titobi PCR ko ni ibamu pẹlu iwọn ti a nireti, boya nla tabi kekere, tabi nigbakan mejeeji awọn ẹgbẹ iṣapẹẹrẹ kan pato ati awọn ẹgbẹ titobi ti kii ṣe pato waye.

A-1 alakoko

Specific Ipilẹ alakoko ti ko dara

——Re-design alakoko.

Concentration Ifojusi alakoko ti ga ju ——Si alekun iwọn otutu denaturation daradara ati fa akoko denaturation sii.

A-2 Mg²⁺ fojusi

M Mg²⁺ ifọkansi ga ju ——Pipe daradara dinku ifọkansi Mg2+: Mu Mg dara si²⁺ ifọkansi nipasẹ lẹsẹsẹ awọn aati lati 1 mM si 3 mM pẹlu aarin 0.5 mM lati pinnu Mg ti o dara julọ²⁺ ifọkansi fun awoṣe kọọkan ati alakoko.

A-3 Polymerase Thermostable

Amount Iye ensaemusi ti o pọ ju—— Din iye enzymu ni deede ni awọn aaye arin 0.5 U.

A-4 Afikun iwọn otutu

Temperature Iwọn otutu imukuro ti lọ silẹ pupọ ——Bi iwọntunwọnsi iwọn otutu ti o yẹ sii tabi gba ọna imuduro ipele meji

Awọn iyipo A-5 PCR

Cy Awọn iyipo PCR lọpọlọpọ ju—— Din nọmba awọn iyika PCR din.

A-1 alakoko—— Pataki ti ko dara —— Tun-ṣe apẹrẹ alakoko, yi ipo pada ati gigun ti alakoko lati jẹki pataki rẹ; tabi ṣe PCR iteeye.

A-2 Àdàkọ DNA

——Awọn awoṣe ko jẹ mimọ ——Sọ awoṣe naa tabi yọ DNA jade pẹlu awọn ohun elo iwẹnumọ.

A-3 Mg²⁺ fojusi

——Mg²⁺ ifọkansi ga ju ——Rege daradara Mg²⁺ fojusi: Mu Mg naa dara si²⁺ ifọkansi nipasẹ lẹsẹsẹ awọn aati lati 1 mM si 3 mM pẹlu aarin 0.5 mM lati pinnu Mg ti o dara julọ²⁺ ifọkansi fun awoṣe kọọkan ati alakoko.

A-4 dNTP

—— Ifojusi ti awọn dNTP ga pupọ —— Dinku ifọkansi ti dNTP ni deede

A-5 Afikun iwọn otutu

—— Iwọn otutu imunilara kekere —— Ṣe deede mu iwọn otutu imukuro pọ si

Awọn iyipo A-6

——Ti ọpọlọpọ awọn iyipo —— Ṣe alekun nọmba ọmọ naa

Igbesẹ akọkọ ni lati yan polymerase ti o yẹ. Polymerase Taq deede ko le ṣe atunyẹwo nitori aini iṣẹ ṣiṣe exonuclease 3'-5 ', ati aiṣedeede yoo dinku ṣiṣe itẹsiwaju ti awọn ajẹkù. Nitorinaa, polymerase Taq deede ko le ṣe alekun awọn aleebu ti o tobi ju 5 kb lọ. Taq polymerase pẹlu iyipada pataki tabi polymerase iṣootọ giga miiran yẹ ki o yan lati mu ilọsiwaju itẹsiwaju pọ si ati pade awọn iwulo ti titobi ida gigun. Ni afikun, titobi ti awọn ajẹkù gigun tun nilo atunṣe ibamu ti apẹrẹ alakoko, akoko denaturation, akoko itẹsiwaju, pH ifipamọ, ati bẹbẹ lọ Nigbagbogbo, awọn alakoko pẹlu 18-24 bp le ja si ikore ti o dara julọ. Lati le ṣe idiwọ ibajẹ awoṣe, akoko denaturation ni 94 ° C yẹ ki o dinku si iṣẹju -aaya 30 tabi kere si fun iyipo, ati akoko lati dide iwọn otutu si 94 ° C ṣaaju ki titobi yẹ ki o kere si iṣẹju 1. Pẹlupẹlu, ṣiṣeto iwọn otutu itẹsiwaju ni iwọn 68 ° C ati apẹrẹ akoko itẹsiwaju ni ibamu si oṣuwọn ti 1 kb/min le rii daju imudara to munadoko ti awọn ajẹkù gigun.

Iwọn aṣiṣe ti imudara PCR le dinku nipa lilo ọpọlọpọ awọn polymerases DNA pẹlu iṣootọ giga. Laarin gbogbo awọn polymerases Taq DNA ti a rii titi di isisiyi, enzymu Pfu ni oṣuwọn aṣiṣe ti o kere julọ ati iṣootọ giga julọ (wo tabili ti a so mọ). Ni afikun si yiyan enzymu, awọn oniwadi le dinku iwọn iyipada PCR siwaju nipasẹ imudarasi awọn ipo iṣesi, pẹlu iṣapeye idapọmọra ifamọra, ifọkansi ti polymerase thermostable ati iṣapeye nọmba ọmọ PCR.