■ Rọrun ati yiyara: Ohun elo naa gba imọ-ẹrọ isọdọtun plasmid ti kii ṣe okun. O nilo awọn igbesẹ 4 nikan lati mọ iyipada lati igara iru egan si igara ẹda, laisi akoko-n gba ati awọn igbesẹ iṣẹ ṣiṣe bii awọn iyipo pupọ ti PCR ati iṣẹ-abẹ.
Prim Alakoko iṣẹ ṣiṣe to gaju: Ohun elo naa gba opo ti apẹrẹ alakọbẹrẹ ni apakan, ki a le gba awọn plasmids pupọ diẹ sii nipasẹ titobi.
Applicable Wulo ni ibigbogbo: Ohun elo naa ko le ṣe iyipada aaye nikan, ṣugbọn tun iyipada pupọ-aaye. O le ṣe iyipada si awọn aaye 5.
Adapt Imudara ti o lagbara: Ohun elo naa le ṣe iyipada-itọsọna aaye lori awọn pilasima pẹlu iwọn ti o pọju ti 10 kb, ni ipilẹ bo gbogbo awọn plasmids ti a lo nigbagbogbo.
Rate Oṣuwọn iyipada giga: ohun elo naa ni iṣẹ ti tito nkan lẹsẹsẹ meji ti awọn awoṣe plasmid methylated ni fitiro ati ni vivo, aridaju oṣuwọn iyipada ti o ga julọ.
■ Fun iṣipopada aaye ọpọlọpọ awọn aaye alakọbẹrẹ, oṣuwọn iyipada yoo kere ju ti iyipada aaye kan ṣoṣo nitori nọmba ti o pọ si ti awọn aaye iyipada. Gẹgẹbi data idanwo wa, nigbati nọmba awọn aaye iyipada ba de 5, oṣuwọn rere iyipada yoo dinku si 50%. Nitorinaa, ninu ọran yii, o ni iṣeduro lati mu nọmba awọn ere ibeji jẹrisi.
■ Ohun elo naa ṣe atilẹyin iyipada pupọ-alakoko pupọ-aaye, ki awọn adanwo iyipada le ṣee ṣe ni nigbakannaa ni sakani jiini ti o gbooro. Iwọn oke ti nọmba ti awọn aaye iyipada jẹ ṣi 5.
A daba pe awọn plasmids iṣakoso ati awọn alakoko ti a pese ninu ohun elo yẹ ki o lo nigba ṣiṣe awọn adanwo iyipada tuntun lati jẹ ki itupalẹ awọn iṣoro idanwo.
Gbogbo awọn ọja le ṣe adani fun ODM/OEM. Fun awọn alaye,jọwọ tẹ Iṣẹ adani (ODM/OEM)
A-1 Àdàkọ
Template Awoṣe naa ni awọn idoti amuaradagba tabi awọn alatako Taq, ati bẹbẹ lọ——— Ṣe awoṣe DNA di mimọ, yọ awọn idoti amuaradagba kuro tabi yọ DNA awoṣe kuro pẹlu awọn ohun elo iwẹnumọ.
Kikopa ti awoṣe ko pari ——Bi o ṣe yẹ ki o mu iwọn otutu denaturation pọ si ati mu akoko denaturation gun.
Deg Irẹwẹsi awoṣe --— Tun-mura awoṣe naa.
A-2 alakoko
Quality Didara to dara ti awọn alakoko ——Re-synthesize primer.
Deg Irẹjẹ alakọbẹrẹ ——Aliquot awọn alakoko ifọkansi giga sinu iwọn kekere fun titọju. Yago fun didi pupọ ati thawing tabi igba pipẹ 4 ° C cryopreserved.
Design Apẹrẹ aipe ti awọn alakoko (fun apẹẹrẹ ipari alakoko ko to, dimer ti a ṣe laarin awọn alakoko, ati bẹbẹ lọ) -Resesign primers (yago fun dida ti alakoko alakoko ati eto ile -iwe keji)
A-3 Mg2+fojusi
G Mg2+ ifọkansi ti lọ silẹ pupọ ——Pi alekun Mg daradara2+ fojusi: Mu Mg naa dara si2+ ifọkansi nipasẹ lẹsẹsẹ awọn aati lati 1 mM si 3 mM pẹlu aarin 0.5 mM lati pinnu Mg ti o dara julọ2+ ifọkansi fun awoṣe kọọkan ati alakoko.
A-4 Afikun iwọn otutu
Temperature Iwọn otutu otutu ti o ga yoo ni ipa lori isopọ ti alakoko ati awoṣe. —— Din iwọn otutu fifẹ silẹ ki o mu ipo naa dara pẹlu gradient ti 2 ° C.
A-5 Ifaagun akoko
Time Akoko itẹsiwaju kukuru —— Mu akoko itẹsiwaju pọ si.
Phenomena: Awọn ayẹwo ti ko dara tun ṣafihan awọn ẹgbẹ ọkọọkan ibi -afẹde.
A-1 Kontaminesonu ti PCR
Koja kontaminesonu ti ọkọọkan ibi -afẹde tabi awọn ọja imudarasi—— Ṣọra ki a ma ṣe fa fifalẹ ayẹwo ti o ni ọkọọkan ibi -afẹde ninu ayẹwo odi tabi da wọn jade kuro ninu tube centrifuge. Awọn reagents tabi ohun elo yẹ ki o jẹ adaṣe lati yọkuro awọn acids nucleic ti o wa, ati pe aye ti kontaminesonu yẹ ki o pinnu nipasẹ awọn adanwo iṣakoso odi.
Contamin Kontaminesonu reagent ——Aliquot awọn reagents ati fipamọ ni iwọn otutu kekere.
A-2 NOMBAr
G Mg2+ ifọkansi ti lọ silẹ pupọ ——Pi alekun Mg daradara2+ fojusi: Mu Mg naa dara si2+ ifọkansi nipasẹ lẹsẹsẹ awọn aati lati 1 mM si 3 mM pẹlu aarin 0.5 mM lati pinnu Mg ti o dara julọ2+ ifọkansi fun awoṣe kọọkan ati alakoko.
Design Apẹrẹ alakọbẹrẹ ti ko pe, ati ọkọọkan ibi-afẹde naa ni isọdọkan pẹlu tito lẹsẹsẹ ti kii ṣe ibi-afẹde. ——Re-design alakoko.
Phenomena: Awọn ẹgbẹ titobi PCR ko ni ibamu pẹlu iwọn ti a nireti, boya nla tabi kekere, tabi nigbakan mejeeji awọn ẹgbẹ iṣapẹẹrẹ kan pato ati awọn ẹgbẹ titobi ti kii ṣe pato waye.
A-1 alakoko
Specific Ipilẹ alakoko ti ko dara
——Re-design alakoko.
Concentration Ifojusi alakoko ti ga ju ——Si alekun iwọn otutu denaturation daradara ati fa akoko denaturation sii.
A-2 Mg2+ fojusi
M Mg2+ ifọkansi ga ju ——Pipe daradara dinku ifọkansi Mg2+: Mu Mg dara si2+ ifọkansi nipasẹ lẹsẹsẹ awọn aati lati 1 mM si 3 mM pẹlu aarin 0.5 mM lati pinnu Mg ti o dara julọ2+ ifọkansi fun awoṣe kọọkan ati alakoko.
A-3 Polymerase Thermostable
Amount Iye ensaemusi ti o pọ ju—— Din iye enzymu ni deede ni awọn aaye arin 0.5 U.
A-4 Afikun iwọn otutu
Temperature Iwọn otutu imukuro ti lọ silẹ pupọ ——Bi iwọntunwọnsi iwọn otutu ti o yẹ sii tabi gba ọna imuduro ipele meji
Awọn iyipo A-5 PCR
Cy Awọn iyipo PCR lọpọlọpọ ju—— Din nọmba awọn iyika PCR din.
A-1 alakoko—— Pataki ti ko dara —— Tun-ṣe apẹrẹ alakoko, yi ipo pada ati gigun ti alakoko lati jẹki pataki rẹ; tabi ṣe PCR iteeye.
A-2 Àdàkọ DNA
——Awọn awoṣe ko jẹ mimọ ——Sọ awoṣe naa tabi yọ DNA jade pẹlu awọn ohun elo iwẹnumọ.
A-3 Mg2+ fojusi
——Mg2+ ifọkansi ga ju ——Rege daradara Mg2+ fojusi: Mu Mg naa dara si2+ ifọkansi nipasẹ lẹsẹsẹ awọn aati lati 1 mM si 3 mM pẹlu aarin 0.5 mM lati pinnu Mg ti o dara julọ2+ ifọkansi fun awoṣe kọọkan ati alakoko.
A-4 dNTP
—— Ifojusi ti awọn dNTP ga pupọ —— Dinku ifọkansi ti dNTP ni deede
A-5 Afikun iwọn otutu
—— Iwọn otutu imunilara kekere —— Ṣe deede mu iwọn otutu imukuro pọ si
Awọn iyipo A-6
——Ti ọpọlọpọ awọn iyipo —— Ṣe alekun nọmba ọmọ naa
Igbesẹ akọkọ ni lati yan polymerase ti o yẹ. Polymerase Taq deede ko le ṣe atunyẹwo nitori aini iṣẹ ṣiṣe exonuclease 3'-5 ', ati aiṣedeede yoo dinku ṣiṣe itẹsiwaju ti awọn ajẹkù. Nitorinaa, polymerase Taq deede ko le ṣe alekun awọn aleebu ti o tobi ju 5 kb lọ. Taq polymerase pẹlu iyipada pataki tabi polymerase iṣootọ giga miiran yẹ ki o yan lati mu ilọsiwaju itẹsiwaju pọ si ati pade awọn iwulo ti titobi ida gigun. Ni afikun, titobi ti awọn ajẹkù gigun tun nilo atunṣe ibamu ti apẹrẹ alakoko, akoko denaturation, akoko itẹsiwaju, pH ifipamọ, ati bẹbẹ lọ Nigbagbogbo, awọn alakoko pẹlu 18-24 bp le ja si ikore ti o dara julọ. Lati le ṣe idiwọ ibajẹ awoṣe, akoko denaturation ni 94 ° C yẹ ki o dinku si iṣẹju -aaya 30 tabi kere si fun iyipo, ati akoko lati dide iwọn otutu si 94 ° C ṣaaju ki titobi yẹ ki o kere si iṣẹju 1. Pẹlupẹlu, ṣiṣeto iwọn otutu itẹsiwaju ni iwọn 68 ° C ati apẹrẹ akoko itẹsiwaju ni ibamu si oṣuwọn ti 1 kb/min le rii daju imudara to munadoko ti awọn ajẹkù gigun.
Iwọn aṣiṣe ti imudara PCR le dinku nipa lilo ọpọlọpọ awọn polymerases DNA pẹlu iṣootọ giga. Laarin gbogbo awọn polymerases Taq DNA ti a rii titi di isisiyi, enzymu Pfu ni oṣuwọn aṣiṣe ti o kere julọ ati iṣootọ giga julọ (wo tabili ti a so mọ). Ni afikun si yiyan enzymu, awọn oniwadi le dinku iwọn iyipada PCR siwaju nipasẹ imudarasi awọn ipo iṣesi, pẹlu iṣapeye idapọmọra ifamọra, ifọkansi ti polymerase thermostable ati iṣapeye nọmba ọmọ PCR.
Lati idasile rẹ, ile -iṣẹ wa ti n dagbasoke awọn ọja kilasi akọkọ pẹlu titẹle ilana naa
ti didara akọkọ. Awọn ọja wa ti ni orukọ ti o dara julọ ni ile -iṣẹ ati igbẹkẹle ti o niyelori laarin awọn alabara tuntun ati arugbo ..