FastKing Igbesẹ Ọkan RT-PCR Kit

A-1 RNA ti bajẹ

—— Sọ RNA didara ga di mimọ laisi kontaminesonu. Ohun elo lati eyiti RNA ti yọ jade yẹ ki o jẹ alabapade bi o ti ṣee ṣe lati ṣe idiwọ ibajẹ RNA. Ṣe itupalẹ iduroṣinṣin RNA lori jeli ti a ti sọ ṣaaju iṣesi RT. Lẹhin isediwon RNA, o yẹ ki o wa ni fipamọ ni 100% formamide. Ti a ba lo onidalẹkun RNase, iwọn otutu alapapo yẹ ki o jẹ <45 ° C, ati pe pH yẹ ki o kere ju 8.0, bibẹẹkọ oludena yoo tu gbogbo RNase ti a dè silẹ. Pẹlupẹlu, oludena RNase yẹ ki o ṣafikun ni awọn solusan ti o ni ≥ 0.8 mM DTT.

A-2 RNA ni awọn onidalẹkun ti awọn aati ifa transcription

—— Awọn onigbọwọ ifasilẹhin sẹhin pẹlu SDS, EDTA, glycerol, sodium pyrophosphate, spermidine, formamide, iyọ guanidine, ati bẹbẹ lọ Dapọ iṣakoso RNA pẹlu ayẹwo, ki o ṣe afiwe ikore pẹlu iṣesi RNA iṣakoso lati ṣayẹwo boya oniduro wa. Wẹ ojoriro RNA pẹlu 70% (v/v) ethanol lati yọ awọn alatako kuro.

A-3 Imunilara ti ko to ti awọn alakoko ti a lo fun sisọpọ okun akọkọ ti cDNA

—— Ṣe ipinnu pe iwọn otutu imukuro dara fun awọn alakoko ti a lo ninu idanwo naa. Fun awọn hexamers laileto, o ni iṣeduro lati tọju iwọn otutu ni 25 ° C fun iṣẹju 10 ṣaaju ki o to de iwọn otutu lenu. Fun awọn alakoko-jiini pato (GSP), gbiyanju GSP miiran, tabi yipada si oligo (dT) tabi hexamer laileto.

A-4 Iye kekere ti ibẹrẹ RNA

—— Mu iye RNA pọ si. Fun awọn ayẹwo RNA ti o kere ju 50 ng, 0.1 μg si 0.5 μg acetyl BSA le ṣee lo ni idapọ cDNA okun akọkọ

A-5 Ọkọọkan ibi-afẹde ko han ninu awọn ara ti a ṣe itupalẹ.

—— Gbiyanju awọn sẹẹli miiran.

Idahun A-6 PCR kuna

—— Fun RT-PCR meji-igbesẹ, awoṣe cDNA ninu igbesẹ PCR ko le kọja 1/5 ti iwọn ifura.

A-1 Annealing Non-kan pato ti awọn alakoko ati awọn awoṣe

—— 3'-opin awọn alakoko ko yẹ ki o ni 2-3 dG tabi dC. Lo awọn alamọdaju Gene-kan pato ni kolaginni okun akọkọ dipo awọn alakoko tabi oligo (dT). Lo iwọn otutu imunilara ti o ga julọ ni awọn akoko diẹ akọkọ, ati lẹhinna iwọn otutu imukuro isalẹ. Lo polymerase Taq DNA ibẹrẹ-gbona fun PCR lati ni ilọsiwaju pataki ti iṣe.

A-2 Apẹrẹ ti ko dara ti awọn alakoko pato-jiini

—— Tẹle awọn ipilẹ kanna fun apẹrẹ alakoko titobi.

A-3 RNA ti doti pẹlu DNA jiini

—— Ṣe itọju RNA pẹlu DNase-ite PCR I. Ṣeto iṣesi iṣakoso laisi atunkọ atunkọ lati rii kontaminesonu DNA.

A-4 Ṣiṣẹda dimer alakoko

—— Ṣe apẹrẹ awọn alakọbẹrẹ laisi awọn tito lẹsẹsẹ ni ipari 3 '.

A-5 Mg ga pupọ²⁺ fojusi

—— Mu Mg dara si²⁺ ifọkansi fun awoṣe kọọkan ati apapọ alakoko

A-6 Ti doti pẹlu DNA ajeji

—— Lo awọn imọran ti o ni agbara aerosol ati awọn ensaemusi UDG.

A-1 Awọn akoonu ti ọja okun akọkọ ga pupọ

—— Din iye ọja ọja okun akọkọ ni igbesẹ ihuwasi PCR ti aṣa.

A-2 Iye alakoko ti o ga pupọ ni ifesi PCR

—— Din igbewọle alakoko silẹ.

A-3 Awọn ọna pupọ pupọ

—— Ṣe alekun awọn ipo ifesi PCR ati dinku nọmba ọmọ PCR.

A-4 Iwọn otutu imukuro ti o kere pupọ

—— Ṣe alekun iwọn otutu imukuro lati yago fun ipilẹṣẹ ati itẹsiwaju ti kii ṣe pato.

A-5 Imudara ti kii ṣe pato ti awọn ajẹkù oligonucleotide ti ipilẹṣẹ nipasẹ ibajẹ DNase ti DNA ——Yọ RNA ti o ni agbara giga lati yago fun kontaminesonu DNA.

RT-PCR ni lati yiyipada kikọ RNA sinu cDNA, ati lẹhinna lo cDNA ti a ti kọ sẹhin bi awoṣe fun ifesi PCR lati mu alekun ibi-afẹde pọ si. Yan boya awọn alakọbẹrẹ laileto, Oligo dT ati awọn alakoko pato jiini ni ibamu si awọn ipo kan pato ti idanwo naa. Gbogbo awọn alakoko ti o wa loke le ṣee lo fun mRNA sẹẹli eukaryotic kukuru laisi ipilẹ irun ori.

Alakoko ID: Dara fun RNA gigun pẹlu eto irun ori, ati gbogbo iru RNA bii rRNA, mRNA, tRNA, ati bẹbẹ lọ Wọn lo nipataki fun iṣesi RT-PCR ti awoṣe kan.

Oligo dT: Dara fun RNA pẹlu iru PolyA (RNA prokaryotic, eukaryotic Oligo dT rRNA ati tRNA ko ni iru PolyA). Nitori Oligo dT ti wa ni asopọ si iru PolyA, didara awọn ayẹwo RNA ni a nilo lati ga, ati paapaa iye kekere ti ibajẹ yoo dinku iye ti iṣelọpọ cDNA ni kikun.

Alakoko-jiini pato: Afikun si ọkọọkan awoṣe, o dara fun awọn ipo nibiti o ti mọ ọkọọkan ibi-afẹde naa.

Awọn ọna meji lo wa:

1. Ọna itọkasi inu: Ni imọran, cDNA jẹ awọn ajẹmu DNA ti awọn gigun oriṣiriṣi, nitorinaa abajade ti electrophoresis jẹ smear. Ti opo RNA ba lọ silẹ, ko si ọja ti yoo fihan ni electrophoresis, ṣugbọn eyi ko tumọ si pe ko si ọja ti yoo pọ si nipasẹ PCR. Ni gbogbogbo, itọkasi inu le ṣee lo lati rii cDNA. Ti itọkasi inu ba ni awọn abajade, didara cDNA le jẹ iṣeduro ni ipilẹ (ni awọn ọran diẹ, ti abala jiini ibi -afẹde ba gun ju, awọn imukuro le wa).

2. Ti jiini ti o mọ ba pọ si nipasẹ awoṣe yii, o le jẹrisi nipasẹ awọn alakoko ti jiini yii. Imudara ti itọkasi inu ko tumọ si pe ko si iṣoro pẹlu cDNA. Nitori itọkasi inu ni opo lọpọlọpọ ni cDNA, o rọrun lati pọ si. Ti cDNA ba jẹ ibajẹ ni apakan fun awọn idi pupọ, lati irisi iṣeeṣe, awọn abajade PCR ti awọn jiini ibi -afẹde lọpọlọpọ yoo ni ipa pupọ. Lakoko ti itọkasi inu jẹ ṣi ga ni ọpọlọpọ, titobi yoo jasi ko kan.

Dabaru apakan ti RNA. Ṣawari iduroṣinṣin ati sọ di mimọ ti RNA

Awọn akoonu RNA ti awọn oriṣiriṣi oriṣiriṣi le yatọ, ṣugbọn ni apapọ, apapọ RNA ti a fa jade yẹ ki o ni awọn ẹgbẹ 28S ati 18S ti o han ninu electrophoresis jeli, ati imọlẹ ti ẹgbẹ iṣaaju yẹ ki o jẹ ilọpo meji ga bi ti igbehin. Ẹgbẹ 5S tọka pe RNA ti bajẹ, ati pe imọlẹ rẹ jẹ iwọn si iwọn ibajẹ. Ilọsiwaju aṣeyọri ti itọkasi inu ko tumọ si pe ko si iṣoro pẹlu RNA, nitori itọkasi inu jẹ lọpọlọpọ, RNA le pọ si niwọn igba ti ibajẹ naa ko buru. OD₂₆₀/OD₂₈₀ipin ti RNA mimọ ti a wọn nipasẹ spectrophotometer yẹ ki o wa laarin 1.9 ati 2.1. Iye kekere ti aimọ ti amuaradagba ni RNA yoo dinku ipin naa. Niwọn igba ti iye ko kere pupọ, RT kii yoo kan. Ohun ti o ṣe pataki julọ fun RT jẹ iduroṣinṣin RNA.

Ifaagun ti jiini itọkasi inu le fihan nikan pe RT ti ṣaṣeyọri, ṣugbọn kii ṣe dandan ni ibatan si didara okun cDNA. Nitori awọn ajẹkù itọkasi inu jẹ gbogbo kekere ni iwọn ati giga ni ikosile, wọn rọrun lati ṣaṣeyọri ni atunkọ atunkọ. Sibẹsibẹ, iwọn ati ikosile ti jiini ibi -afẹde yatọ lati jiini si jiini. Didara cDNA ko le ṣe idajọ nikan nipasẹ itọkasi inu paapaa fun awọn ajẹkù ibi -afẹde to gun ju 2 kb.

Diẹ ninu awọn ayẹwo ni awọn ẹya ile -iwe giga ti eka, tabi ni akoonu GC ọlọrọ, tabi jẹ iyebiye pẹlu opo lọpọlọpọ. Ni awọn ọran wọnyi, transcriptase ti o yẹ yẹ ki o yan ni ibamu si iwọn ti ibi -afẹde ibi -afẹde ati apẹẹrẹ. Fun awọn awoṣe RNA pẹlu akoonu GC giga ati eto ile -ẹkọ giga ti o nira, o nira lati ṣii eto ile -iwe ni iwọn otutu kekere, tabi pẹlu transcriptase idakeji. Fun awọn awoṣe wọnyi, Quant Reverse Transcriptase ni a le yan, niwọn igba ti iṣipopada iṣipopada rẹ han gedegbe dara ju ti M-MLV lẹsẹsẹ transcriptase, eyiti o le yiyipada awọn oriṣiriṣi awọn awoṣe RNA daradara ati ṣe igbasilẹ RNA sinu okun akọkọ cDNA si iye ti o pọju. Nigbati o ba nlo ohun elo transcriptase idakeji gbogbogbo, eto 20 μl le ṣe ifilọlẹ ifisilẹ daradara ni kikọ 1 μg ti RNA lapapọ. Jọwọ ṣe akiyesi si agbara RT ti o pọju ti ohun elo. Ti o ba ṣafikun awoṣe ni apọju, atunkọ iṣipopada yoo ṣe ojurere RNA pẹlu opo lọpọlọpọ. Nitorinaa, o dara ki a ma kọja agbara ti o pọju ti eto naa.

A-1 pinnu boya RNA ti bajẹ pupọ ati ti RT ba ṣaṣeyọri

Ni gbogbogbo, idi fun ikuna ti itọkasi itọkasi inu jẹ igbagbogbo nipasẹ ibajẹ RNA to ṣe pataki. Idi miiran ti o ṣeeṣe jẹ ikuna transcription yiyipada. Itọkasi inu ko le ṣee lo bi idiwọn lati ṣe idajọ didara okun cDNA ẹyọkan, ṣugbọn o le ṣee lo bi idiwọn lati ṣe idajọ boya atunkọ iyipada jẹ aṣeyọri ti ko ba si iṣoro ti didara RNA. Ohun pataki julọ ninu ilana iṣipopada idakeji ni lati ṣetọju iwọn otutu igbagbogbo ati eto ifura igbagbogbo lati le mu ilọsiwaju iṣiṣẹ sii.

A-2 Pinnu boya awọn alakoko fun titobi awọn jiini itọkasi inu jẹ igbẹkẹle ati ti awọn iṣoro eyikeyi ba wa pẹlu awọn atunlo ti a lo ninu PCR.

Fun titọwọn ibatan, RNA gbọdọ jẹ iwọn ṣaaju iṣipopada iṣipopada, eyiti o tun nilo ninu ọpọlọpọ awọn ohun elo idapada, fun apẹẹrẹ, ṣe iwọn igbewọle RNA bi 1 μg. Niwọn igba ti idapada cDNA jẹ ojutu idapọmọra, pẹlu RNA, oligo dT, enzymu, dNTP, ati paapaa iyoku DNA diẹ, iyapa yoo waye, nitorinaa ko ṣee ṣe lati ṣe iṣiro cDNA ni deede. Nitorinaa, titobi RNA jẹ pataki. Ṣiyesi ṣiṣe iṣipopada iṣipopada jẹ kanna laarin awọn ayẹwo oriṣiriṣi, iye cDNA ti o gba yẹ ki o jẹ kanna, ati onínọmbà titobi le ṣafihan lafiwe ti awọn ipele ikosile ti awọn jiini oriṣiriṣi ni iye kanna ti RNA lapapọ. Nigbati o ba n ṣe PCR pipo ti o ni ibatan fluorescence, cDNA pipo le ma nilo lẹhin transcription iyipada nitori jiini itọkasi inu le ṣe bi itọkasi.

O jẹ ibatan nipataki si awọn jiini, ati yiyipada kikọ ti ajẹku gigun ko ṣee ṣe fun ọpọlọpọ awọn jiini. Ni akọkọ, ṣiṣe ti iṣipopada iṣipopada kere pupọ ju ti PCR lọ. Ni ẹẹkeji, agbegbe ọlọrọ GC ati eto ile -ẹkọ giga ti ọpọlọpọ awọn jiini ni ihamọ mejeeji transcription iyipada ati PCR. Lakotan, iṣootọ ati ṣiṣe imudara ti PCR nira lati ṣe iṣeduro ni akoko kanna. Ninu ilana atunkọ iyipada, ko si ẹnikan ti o le ṣe iṣeduro lati gba ida gigun fun awọn jiini ẹda kekere, ni pataki lilo oligo dT. Bi fun 5 'UTR pẹlu GC diẹ sii, o nira paapaa. Nitorinaa, o tun jẹ ọna ti o ni ironu lati yiyipada iwe afọwọkọ pẹlu awọn alakọbẹrẹ laileto, wa awọn aaye fifin adayeba ni abala ibi -afẹde, pọ si nipasẹ awọn apakan, ati lẹhinna ṣe tito nkan lẹsẹsẹ ihamọ ati isọmọ. Ni gbogbogbo, o nira lati ṣe alekun awọn ajẹkù taara ti o tobi ju 2 kb, ṣugbọn kii ṣe igbagbogbo ko ṣee ṣe lati gba: 1. Ni akọkọ, ṣe iṣeduro iduroṣinṣin ti RNA/mRNA, ati isediwon TRIZOL ni o fẹ. 2.M-MLV RT-PCR kit le ṣee lo taara. Fa akoko ifisilẹ ati mu nọmba ọmọ pọ si ninu ilana imudara daradara. Ni omiiran, PCR itẹ -ẹiyẹ le ṣee lo, tabi ṣe awọn aati meji tabi meji ni akọkọ pẹlu idawọle ti o gbooro deede ati akoko itẹsiwaju ṣaaju imudara PCR deede, eyiti o le ṣe iranlọwọ lati fa awọn ajẹkù. San ifojusi si iṣootọ ti polymerase. 3.Long Taq le ṣee lo ni PCR lati gba awọn abajade to peye. 4. Fun ohun elo ikosile amuaradagba, polymerase iṣootọ giga yẹ ki o lo.

Awọn oriṣi meji ti transcriptase ti a funni nipasẹ TIANGEN: Quant/King RTase ati TIANScript M-MLV. Iyatọ akọkọ laarin wọn jẹ iye titẹ awọn awoṣe. Quant jẹ transcriptase alailẹgbẹ, eyiti o yatọ si M-MLV ti a lo nigbagbogbo ti o jade lati ọlọjẹ lukimia Moloney murine. Quant jẹ iṣipopada iṣipopada iṣipopada giga giga tuntun ti a tun ṣe afihan nipasẹ imọ-ẹrọ Escherichia coli. Quant jẹ o dara fun titobi 50 ng-2 μg ti RNA pẹlu iṣẹ ṣiṣe iyipada iyipada giga ati ikore giga. Ti a ṣe afiwe pẹlu MMLV arinrin tabi AMV, abuda nla ti Quant ni pe o ni ibaramu ti o lagbara pupọ pẹlu awọn awoṣe RNA ati pe o le yi awọn awoṣe eka ti iwe afọwọkọ pada laisi denaturation iwọn otutu giga. Fun awọn awoṣe pẹlu akoonu GC ti o ga julọ, ṣiṣe yiyipada ga julọ. Bibẹẹkọ, transcriptase yiyipada ni iṣẹ RNase H, eyiti o le ni ipa gigun ti ọja cDNA (o dara fun <awọn awoṣe 4.5 kb). Fun iwe afọwọkọ yiyipada aṣa, TIANScript MMLV transcriptase ni iṣeduro. RTase yii jẹ enzymu ti a tunṣe pẹlu iṣẹ RNase H ti ko lagbara pupọ, eyiti o dara fun isọdọkan cDNA gigun (> 5 kb).

Atunkọ ifẹhinti igbesẹ-ọkan ati imudara PCR ti pari ni tube kanna laisi ṣiṣi ideri tube laarin iṣelọpọ cDNA ati titobi, eyiti o ṣe iranlọwọ lati dinku kontaminesonu. Niwọn igba ti gbogbo awọn ayẹwo cDNA ti a gba ni a lo fun titobi, ifamọra ga, pẹlu o kere ju 0.01 pg ti RNA lapapọ. Fun aṣeyọri ọkan-igbesẹ RTPCR, awọn alakoko-jiini pato ni a lo ni gbogbogbo lati ṣe ipilẹṣẹ iṣelọpọ cDNA. Ọna-igbesẹ meji, eyun transcription idakeji ati titobi PCR ni a ṣe ni awọn igbesẹ meji. Ni akọkọ yiyipada iwe afọwọkọ ni a gbe jade lati awoṣe RNA lati gba cDNA, ati pe cDNA ti o gba ti wa labẹ ọkan tabi diẹ sii awọn aati PCR oriṣiriṣi. Ọna-ọna igbesẹ meji le lo oligo (dT) tabi awọn alakọbẹrẹ laileto lati ṣe itọsọna isọdọkan ti okun akọkọ ti cDNA, ati pe o le yiyipada kikọ gbogbo alaye mRNA lati inu apẹẹrẹ kan pato.