Apo Ibi ikawe DirectFast TIANSeq (itanna)

Ni lọwọlọwọ, imọ-ẹrọ tito nkan lẹsẹsẹ giga jẹ ipilẹ ti o da lori imọ-ẹrọ itẹlera iran atẹle. Bi ipari kika ti imọ -ẹrọ tito nkan lẹsẹsẹ ti ni opin, a gbọdọ fọ tito gigun ni kikun si awọn ile ikawe kekere si tito lẹsẹsẹ. Ni ibamu si awọn iwulo ti awọn adanwo tito nkan lẹsẹsẹ, a yan igbagbogbo ti o pari ọkan tabi tito lẹẹmeji. Lọwọlọwọ awọn ajẹkù DNA ti ile-ikawe tito nkan lẹsẹsẹ ni a pin kaakiri ni sakani 200-800 bp.

a) DNA ko dara ni didara ati pe o ni awọn oludena. Lo awọn ayẹwo DNA ti o ni agbara giga lati yago fun idiwọ iṣẹ ṣiṣe enzymu.

b) Iye ayẹwo DNA ko to nigba lilo ọna ti ko ni PCR lati kọ ile-ikawe DNA. Nigbati titẹ sii ti DNA ti a pin si ti kọja 50 ng, iṣiṣẹ ṣiṣiṣẹ PCR-ọfẹ le ṣee yan ni yiyan lakoko ilana ikole ile-ikawe. Ti nọmba ẹda ti ile -ikawe ba kere pupọ lati jẹ tito lẹsẹsẹ taara, ile -ikawe DNA le pọ si nipasẹ PCR lẹhin isọmọ ohun ti nmu badọgba.

c) Kontaminesonu RNA yori si aiṣedeede ipilẹ DNA akọkọ aiṣedeede RNA kontaminesonu le wa ninu ilana isọdọmọ ti DNA jiini, eyiti o le ja si wiwọn DNA ti ko pe ati ikojọpọ DNA ti ko to lakoko ikole ile -ikawe. RNA le yọ kuro nipa itọju pẹlu RNase.

A-1

a) Awọn ajẹkù kekere (60 bp-120 bp) han Awọn ajẹkù kekere jẹ igbagbogbo awọn ajẹkù ohun ti nmu badọgba tabi awọn dimers ti a ṣe nipasẹ awọn oluyipada. Iwẹnumọ pẹlu awọn ilẹkẹ oofa Agencourt AMPure XP le yọkuro awọn ajẹkù adaṣe wọnyi ni idaniloju ati rii daju didara tito nkan lẹsẹsẹ.

b) Awọn ajẹkù ti o tobi han ninu ile -ikawe lẹhin titobi PCR Iwọn ti ajẹkù DNA ile -ikawe yoo pọ si nipasẹ 120 bp lẹhin ti ohun ti nmu badọgba ti sopọ. Ti ida DNA ba pọ si nipasẹ diẹ ẹ sii ju 120 bp lẹhin isọdọmọ ohun ti nmu badọgba, o le fa nipasẹ tito nkan lẹsẹsẹ ajeji ti titobi PCR ti o pọ sii. Idinku nọmba awọn iyipo PCR le ṣe idiwọ ipo naa.

c) Iwọn aibikita ti awọn ajẹkù DNA ile -ikawe lẹhin ligation ohun ti nmu badọgba Ipari ohun ti nmu badọgba ninu ohun elo yii jẹ 60 bp. Nigbati awọn opin meji ti ajeku ba sopọ mọ awọn oluyipada, gigun yoo pọ si nikan nipasẹ 120 bp. Nigbati o ba lo ohun ti nmu badọgba miiran ju eyiti a pese nipasẹ ohun elo yii, jọwọ kan si olupese lati pese alaye ti o wulo gẹgẹbi ipari ohun ti nmu badọgba. Jọwọ rii daju pe iṣiṣẹ idanwo ati iṣẹ tẹle awọn igbesẹ ti a ṣalaye ninu iwe afọwọkọ naa.

d) Iwọn ida ainidi DNA ṣaaju iṣipopada ohun ti nmu badọgba Idi fun iṣoro yii le waye nipasẹ awọn ipo ifura ti ko tọ lakoko pipin DNA. Awọn akoko ifesi oriṣiriṣi yẹ ki o lo fun titẹ sii DNA oriṣiriṣi. Ti titẹ sii DNA ba ju 10 ng lọ, a ṣeduro lati yan akoko ifaseyin ti iṣẹju 12 bi akoko ibẹrẹ fun iṣapeye, ati iwọn ida ti a ṣe ni akoko yii ni pataki ni sakani 300-500 bp. Awọn olumulo le pọ si tabi dinku gigun ti awọn ajẹsara DNA fun iṣẹju 2-4 ni ibamu si awọn ibeere tiwọn lati mu awọn ajẹmu DNA dara si pẹlu iwọn ti a beere.

A-2

a) Akoko aiṣododo ko ni iṣapeye Ti DNA ti o pin ba kere ju tabi tobi pupọ, jọwọ tọka si Awọn Itọsọna fun Aṣayan Akoko Ainidi ti a pese ni itọnisọna lati pinnu akoko ifura, ati lo aaye akoko yii bi iṣakoso, ni afikun ṣeto eto ifura lati pẹ tabi kikuru iṣẹju 3 lati ṣe atunṣe deede diẹ sii lori akoko pipin.

A-3

Pipin iwọn aiṣe deede ti DNA lẹhin itọju ida

a) Ọna thawing ti ko tọ ti reagent Fragmentation, tabi reagent ko ni idapọ patapata lẹhin thawing. Tii 5 × Fragmentation Enzyme Mix reagent lori yinyin. Lọgan ti thawed, dapọ reagent boṣeyẹ nipa rọra yiyi isalẹ ti tube. Maṣe ṣe atunto reagent naa!

b) Ayẹwo titẹ sii DNA ni EDTA tabi awọn idoti miiran Idinku awọn ions iyọ ati awọn aṣoju chelating ni igbesẹ iwẹnumọ DNA jẹ pataki pataki fun aṣeyọri idanwo naa. Ti DNA ba tuka ni 1 × TE, lo ọna ti a pese ninu itọnisọna lati ṣe ipinya. Ti ifọkansi EDTA ninu ojutu ko ni idaniloju, o ni iṣeduro lati sọ DNA di mimọ ki o tuka ninu omi ti a ti sọ di mimọ fun iṣesi atẹle.

c) Pipe DNA ti ko pe ni iwọn Iwọn DNA ti a pin si ni ibatan pẹkipẹki pẹlu iye titẹ sii DNA. Ṣaaju itọju idayatọ, titobi deede ti DNA nipa lilo Qubit, Picogreen ati awọn ọna miiran jẹ pataki lati pinnu iye gangan ti DNA ninu eto ifura.

 d) Igbaradi ti eto ifaseyin ko tẹle itọsọna naa Igbaradi ti eto ifisinu ti a pin si gbọdọ wa ni ṣiṣe lori yinyin muna ni ibamu si awọn ilana naa. Lati rii daju ipa ti o dara julọ, gbogbo awọn paati ifura yẹ ki o gbe sori yinyin ati igbaradi ti eto ifura yẹ ki o ṣe lẹhin itutu agbaiye pipe. Lẹhin igbaradi ti pari, jọwọ yi lọ tabi pipet lati dapọ daradara. Maṣe ṣe afẹfẹ!

1. Ọna idapọ ti ko tọ (iyipo, oscillation iwa -ipa, ati bẹbẹ lọ) yoo fa pinpin ajeji ti awọn ajẹkù ile ikawe (bi o ṣe han ninu eeya ti o tẹle), nitorinaa ni ipa lori didara ile -ikawe naa. Nitorinaa, nigbati o ba ngbaradi idaamu Idahun Fragmentation Mix, jọwọ rọra pipette si oke ati isalẹ lati dapọ, tabi lo ika ika lati yi ati dapọ boṣeyẹ. Ṣọra ki o ma ṣe dapọ pẹlu vortex.

2. DNA mimo giga gbọdọ wa ni lilo fun ikole ile -ikawe

Integrity Iduroṣinṣin DNA ti o dara: Ẹgbẹ electrophoresis jẹ diẹ sii ju 30 kb, laisi iru

OD260/230:> 1.5

■ OD260/280: 1.7-1.9

3. Iye titẹ sii DNA gbọdọ jẹ deede O daba lati lo awọn ọna Qubit ati PicoGreen lati ṣe iwọn DNA, dipo Nanodrop.

4. Akoonu ti EDTA ninu ojutu DNA gbọdọ pinnu pe EDTA ni ipa nla lori ifura ipinya. Ti akoonu ti EDTA ba ga, ṣiṣe itọju DNA nilo lati ṣe ṣaaju idanwo atẹle.

5. Ojutu idapada ipinya gbọdọ wa ni pese sile lori yinyin Ilana idayatọ jẹ ifura si iwọn otutu ati akoko (ni pataki lẹhin fifi imudara sii). Lati le rii daju deede ti akoko ifesi, jọwọ mura eto ifura lori yinyin.

6. Akoko ifura ipinlẹ gbọdọ jẹ deede Akoko ifura ti igbesẹ ipin yoo kan taara iwọn awọn ọja ida, nitorinaa ni ipa lori pinpin titobi ti awọn ajẹmu DNA ninu ile -ikawe.

1. Iru apẹẹrẹ wo ni o wulo fun ohun elo yii?

Iru ayẹwo ti o wulo ti ohun elo yii le jẹ RNA lapapọ tabi mRNA ti a sọ di mimọ pẹlu iduroṣinṣin RNA ti o dara. Ti a ba lo RNA lapapọ lati kọ ile -ikawe naa, o ni iṣeduro lati lo ohun elo idinku rRNA (Cat#4992363/4992364/4992391) lati yọ rRNA kuro ni akọkọ.

2. Njẹ a le lo awọn ayẹwo FFPE lati kọ ile ikawe pẹlu ohun elo yii?

MRNA ninu awọn ayẹwo FFPE yoo bajẹ si iwọn kan, pẹlu iduroṣinṣin ti ko dara. Nigbati o ba nlo ohun elo yii fun ikole ile -ikawe, o ni iṣeduro lati mu akoko akoko pipin sii (kikuru akoko ipinya tabi ko ṣiṣẹ ipinya).

3. Lilo igbesẹ yiyan iwọn ti a pese ninu iwe afọwọkọ ọja, kini o le fa ki apakan ti o fi sii han iyatọ kekere?

Aṣayan iwọn yoo ṣee ṣe ni ibamu ti o muna pẹlu igbesẹ yiyan iwọn ni Afowoyi ọja yii. Ti iyapa ba wa, idi le jẹ pe awọn ilẹkẹ oofa ko ni iwọntunwọnsi si iwọn otutu yara tabi ko ni idapọ ni kikun, pipette ko pe tabi omi naa wa ninu aba. A ṣe iṣeduro lati lo awọn imọran pẹlu ipolowo kekere fun idanwo naa.

4. Asayan ti awọn alamuuṣẹ ni ikole ikawe

Ohun elo ikole ile-ikawe ko ni reagent ohun ti nmu badọgba, ati pe o ni iṣeduro lati lo ohun elo yii papọ pẹlu TIANSeq Adapter In-Index (Illumina) (4992641/4992642/4992378).

5. QC ti ile -ikawe

Wiwa iwọn -ikawe: Qubit ati qPCR ni a lo lati pinnu ifọkansi ibi -pupọ ati ifọkansi molar ti ile -ikawe lẹsẹsẹ. Isẹ naa jẹ muna ni ibamu pẹlu iwe afọwọkọ ọja. Ifojusi ti ile -ikawe yoo pade gbogbo awọn ibeere ti tito lẹsẹsẹ NGS. Iwari ti sakani pinpin ile -ikawe: Lilo Agilent 2100 Bioanalyzer lati rii sakani pinpin ile -ikawe.

6. Asayan ti nọmba ọmọ titobi

Gẹgẹbi awọn ilana naa, nọmba awọn iyipo PCR jẹ 6-12, ati nọmba awọn iyipo PCR ti o nilo yẹ ki o yan ni ibamu si igbewọle ayẹwo. Ni awọn ile ikawe ti o ni ikore, lori titobi nigbagbogbo waye ni awọn iwọn oriṣiriṣi, eyiti o farahan nipasẹ tente oke ti o tobi diẹ lẹhin giga ti sakani ibi-afẹde ni wiwa Agilent 2100 Bioanalyzer, tabi ifọkansi ti a rii ti Qubit kere ju ti qPCR. Ìwọnba lori titobi jẹ iyalẹnu deede, eyiti ko ni ipa lori tito lẹsẹsẹ ikawe ati itupalẹ data atẹle.

7. Spikes yoo han ninu profaili iṣawari ti Agilent 2100 Bioanalyzer

Ifarahan ti awọn spikes ni wiwa Agilent 2100 Bioanalyzer jẹ nitori aiṣedede aiṣedeede ti awọn ayẹwo, nibiti awọn ipin diẹ yoo wa ni iwọn kan, ati pe eyi yoo han diẹ sii lẹhin imudara PCR. Ni ọran yii, a daba pe ki o ma ṣe yiyan iwọn, ie ṣeto ipo ipinya si 94 ° C fun iṣẹju mẹẹdogun 15, nibiti pinpin ipin jẹ kekere ati ogidi, ati isokan le dara si.